OBJETIVO: avaliar a preservação folicular e as características celulares do tecido ovariano criopreservado, em coelhas. MÉTODOS: fez-se, sob anestesia, a ooforectomia direita de dez coelhas brancas, adultas. Dissecou-se o ovário mantendo-se o córtex com espessura de 1,5 milímetros. Fragmentou-se o tecido em pequenas secções, algumas para o estudo histológico de controle e outras destinadas à criopreservação pelo protocolo de congelamento lento. Passadas seis semanas efetuou-se o descongelamento e fez-se a avaliação histológica. As amostras do controle e do experimento, após processamento, foram coradas pela hematoxilina-eosina para identificação dos aspectos histológicos e submetidas à técnica imuno-histoquímica utilizando-se o PCNA (proliferating cell nuclear antigen) para a avaliação da viabilidade celular. Utilizaram-se os testes não paramétricos "comparação entre duas proporções" e Mann-Whitney e o teste paramétrico t de Student. RESULTADOS: observou-se que no tecido criopreservado só persistiram oócitos primordiais. Entre as alterações reversíveis identificaram-se: vacuolização citoplasmática em todas as amostras (p=0,039), lise estromal em 50% (p=0,648) e oócitos com contornos irregulares em 80% (p=0,007). Encontraram-se alterações irreversíveis como degeneração hialina e picnose em 30% das amostras (p=0,210). A análise imuno-histoquímica demonstrou os folículos, em diferentes estágios de desenvolvimento, no tecido não congelado e folículos primordiais no tecido criopreservado com positividade para o PCNA, indicando a presença de DNA ativo. CONCLUSÃO: no tecido ovariano criopreservado sobrevivem apenas os folículos primordiais; existem alterações histológicas reversíveis (vacuolização citoplasmática, lise estromal, fragmentação das células da granulosa e oócitos com contornos irregulares); alterações irreversíveis, em níveis não significantes (degeneração hialina e picnose) e presença de PCNA positivo em todos os folículos.

PURPOSE: to evaluate follicular preservation and histologic characteristics of the cryopreserved ovarian tissue and to compare with the fresh one, in rabbits. METHODS: ten adult female white rabbits were submitted to right oophorectomy. The dried ovary was dissected and the cortex was maintained with approximately 1.5 millimeter thickness. The tissue was fractionated into small sections, some reserved for control histologic study and others destined for cryopreservation. Six weeks later the ovarian tissue was thawed and evaluated histologically. After histologic processing, the control and the experimental samples were stained with hematoxylin and eosin and treated immunohistochemically by the PCNA technique for evaluation of DNA preservation. Histologic alterations present in the fresh and in the cryopreserved tissues were identified, and cryopreserved tissue viability was evaluated. RESULTS: in the cryopreserved tissue only primordial follicles persisted. Reversible alterations were identified: cytoplasmatic vacuolation (p=0,039), stromal lysis (p=0.648) and oocytes with irregular contours (p=0.007). Irreversible alterations: (hyalin degeneration and pyknosis) were found, but not at significant levels (p=0.210). The immunohistochemical analysis showed PCNA staining of follicles at different stages of development in the fresh tissue and primordial follicles in the cryopreserved tissue, indicating the presence of active DNA in both tissues. CONCLUSION: in the cryopreserved ovarian tissue the following were observed: survival of only primordial follicles; significant reversible histologic alterations (cytoplasmic vacuolation, stromal lysis and oocytes with irregular contours); irreversible alterations (hyalin degeneration and pyknosis), and PCNA staining of all follicles.

Objetivos: comparar o desenvolvimento embrionário com o uso de dois métodos diferentes de cultura (meio seqüencial ou co-cultura em células Vero). Métodos: foram incluídas 110 pacientes que tiveram ovócitos aspirados e submetidos à fertilização in vitro. Metade das pacientes teve seus embriões cultivados juntamente com células Vero e a outra metade em meio seqüencial G1:2/G2:2. Os embriões foram transferidos no dia 5 pós-fertilização, após avaliação morfológica, verificando-se a taxa de blastulação. A gravidez foi definida por meio de ultra-sonografia, verificando-se batimento cardíaco após a 13ª semana pós-transferência. Resultados: a taxa de blastocistos expandidos encontrada em nosso estudo foi de 15,9% e 14% com células Vero e G1:2/G2:2, respectivamente. Com células Vero 36,0% das pacientes engravidaram com taxa de implantação de 18,9%. Quando se utilizou G1:2/G2:2 as taxas de gravidez e implantação foram 28,9% e 14,9%, respectivamente. Em apenas 17 casos obtiveram-se blastocistos após co-cultivo em células Vero, apresentando 76,5% de taxa de gravidez e 63,0% de implantação. Quando o cultivo foi em G1/G2 21 pacientes apresentaram blastocistos e as taxas de gravidez e implantação foram de 57,1 e 76,0%, respectivamente. Conclusão: não houve diferença significativa entre as taxas de gravidez ou implantação nos 2 tipos de cultivo. Nos casos em que blastocistos expandidos foram transferidos, as taxas de implantação e gravidez aumentaram com ambos os tipos de cultivo. Nestas pacientes, independente do tipo de cultivo utilizado, um número maior de ovócitos foi obtido, o que nos leva a pensar que não apenas as condições de cultura influenciam as taxas de implantação e gravidez, mas a qualidade dos óvulos também é importante, pois as "boas respondedoras" tiveram melhores resultados.

Purpose: to compare the embryonic development obtained with two different culture methods (sequential medium or coculture in Vero cells). Methods: oocytes were recovered from 110 patients and submitted toin vitro fertilization. The embryos of half of the patients were co-cultured with Vero cells and the embryos of the other half were cultured in sequential G1:2/G2:2 medium for five days. The embryos were transferred on the 5th day after fertilization after morphological evaluation for the determination of blastula formation rate. Pregnancy was defined by ultrasonography and a fetal heartbeat was determined 13 weeks after transfer. Results: the expanded blastocyst rate found in our study was 15.9 and 14% with Vero cells and G1:2/G2:2, respectively. With Vero cells 36.0% of patients became pregnant and the implantation rate was 18.9%. When G1:2/G2:2 was used, the pregnancy and implantation rates were 28.9 and 14.9%, respectively. Only 17 patients had blastocysts after coculture in Vero cells, with a 76.5% pregnancy rate and a 63.5% implantation rate. When embryos were cultured in G1/G2, 21 patients presented blastocysts and the pregnancy and implantation rates were 57.1 and 76.0%, respectively. Conclusion: there was no significant difference in pregnancy or implantation rates between the 2 types of culture. When expanded blastocysts were transferred, the implantation and pregnancy rats increased with both culture types. In these patients, regardless of the type of culture used, a larger number of oocytes was obtained, suggesting that the implantation and pregnancy rates are affected not only by the culture conditions but also by the quality of the eggs, since "good responders" had better results.

Objetivo: montar um protocolo animal para estudo e treinamento em biópsia embrionária. Métodos: ovários de vaca obtidos em abatedouro eram transportados ao laboratório onde os oócitos aspirados eram maturados. Posteriormente eram submetidos à fertilização in vitro. No dia 5 pós-fertilização, os embriões eram biopsiados, com a abertura da zona pelúcida realizada mediante lâmina de corte ajustada ao microscópio óptico. Após abertura da zona pelúcida 1 ou 2 blastômeros eram removidos dos embriões. Após a biópsia, os embriões permaneciam em co-cultivo por mais três dias. Ao final deste tempo, o desenvolvimento dos embriões era avaliado e comparado ao do grupo controle por meio de estudo morfológico e contagem do número de células, usando coloração específica para núcleos. Resultados: dos 57 embriões biopsiados, 40 atingiram o estágio de blastocisto (70,2%) e em 11 foi observado o "hatching" (27,5%). No grupo controle obtiveram-se 42 blastocistos (73,7%) e, destes, 11 chegaram a "hatching" (26,2%). Após contagem do número de células, observou-se que não houve diferença estatisticamente significante entre os 2 grupos. Conclusão: podemos verificar por meio dos resultados que o protocolo proposto foi tecnicamente viável, além de fornecer bom número de embriões, pela facilidade de obtenção de oócitos bovinos, podendo ser adotado para treinamento.

Purpose: to develop an animal model for the study of, and training in, bovine biopsies. Methods: cow ovaries were obtained from a slaughterhouse and transported to the laboratory where the oocytes were aspirated, maturated and submitted to in vitro fertilization. On the 5th day after fertilization, the embryos were biopsied, with the zona pellucida being opened with a cutting blade fitted to the light microscope. One or two blastomeres were removed from the embryos and left in coculture for three additional days. After this time, embryo development was evaluated in comparison to a control group by morphological study and cell counts using specific staining for nuclei. Results: forty of the 57 biopsied embryos reached the blastocyst stage (70.2%) and hatching was observed in 11 (27.5%). Forty-two blastocysts were obtained in the control group (73.7%) and 11 of them hatched (26.2%). Cell counts showed no significant differences between groups. Conclusions: we conclude that the proposed protocol is technically feasible and supplies a good number of embryos because of the easy technique for obtaining bovine oocytes, thus representing a method that could be adopted for training.

Objetivos: determinar se o dia da transferência ou o estágio em que o embrião é transferido interferem nas taxas de gravidez e implantação. Métodos: cento e sete pacientes tiveram seus oócitos aspirados e submetidos à fertilização in vitro. Os embriões foram co-cultivados em células Vero e transferidos no dia 3 ou dia 5 pós-fertilização, após avaliação morfológica. Resultados: a taxa de implantação dos embriões transferidos no dia 5 foi significativamente maior que quando os embriões eram transferidos no dia 3, mas as taxas de gravidez não variaram. Observou-se uma diferença significativa nas taxas de gravidez quando se comparou o estágio em que o embrião era transferido, obtendo-se 70,6% de gravidez quando se transferiam blastocistos expandidos e 20,0% e 10,5% quando eram transferidos blastocistos iniciais ou mórulas, respectivamente. Conclusões: as taxas de implantação e gravidez são significativamente aumentadas quando se transferem embriões em estágio de blastocisto expandido, mas os meios e condições de cultura de que dispomos no momento ainda são insuficientes para nos fornecer uma taxa satisfatória de embriões neste estágio.

Purpose: to determine whether the transfer day or the stage that the embryo is transferred interferes in pregnancy and implantation rates. Methods: oocytes we recovered from 107 patients and submitted to in vitro fertilization. The embryos were cocultured on Vero cells and transferred on day 3 or day 5 post-fertilization, after morphological assessment. Results: the implantation rate of the transferred embryos on day 5 was significantly higher than when the embryos were transferred on day 3, but the pregnacy rates did not change. However, a significant difference was observed in the pregnancy rates for embryos transferred at the expanded blastocyst stage (70.6% of pregnancy) when compared to 20.0% and 10.5% at the earlier blastocyst and morula stages, respectively. Conclusions: the implantation and pregnancy rates were significantly increased when the embryos were transferred at the expanded blastocyst stage, but the culture media and culture conditions now available are not able to provide a satisfactory rate at this stage.